Après avoir étudié au Centre dramatique de Caen, Jacques Gamblin tente sa chance à Paris. Il décroche son premier rôle en 1988 dans Périgord noir de Nicolas Ribowski. Claude Lelouch lui accorde sa confiance en lui proposant d'apparaître dans Il y a des jours... et des lunes, La Belle histoire et Tout ça... pour ça ! (1992). Acteur fidèle, il tourne à deux reprises sous la direction de Laurent Bénégui (Au petit Marguery en 1994 et Mauvais genre en 1996) et de Philippe Lioret (Tenue correcte exigée en 1997 et Mademoiselle en 2000). 1995 se révèle être une année bénéfique pour l'acteur qui collabore coup sur coup avec Bertrand Blier pour Mon homme et Robert Guédiguian pour A la vie, à la mort !.Le public découvre véritablement Jacques Gamblin en homme d'affaires homosexuel et strip-teaseur dans la comédie à succès Pédale douce (1995). Cette prestation "déshabillée" lui vaut une nomination pour le César du Meilleur second rôle masculin en 1997. Acteur confirmé à la fin des années 90, il enchaîne les tournages sous la houlette de Claude Chabrol (Au coeur du mensonge), Shohei Imamura (Kanzo sensei) et Jean Becker (Les Enfants du marais). En 2002, il reçoit le Prix d'interprétation au Festival de Berlin pour sa performance dans Laissez-passer de Bertrand Tavernier. Jacques Gamblin tourne peu mais sait faire preuve de dicernement dans le choix de ses rôles, metteurs en scène et partenaires à l'écran. Il aime aussi à alterner petites productions et projets plus ambitieux. C'est ainsi qu'il s'investira dans le modeste et étrange Carnages puis donnera la réplique à Gérard Lanvin dans A la petite semaine (2003). En 2004, il retrouve Bertrand Tavernier sous la direction duquel il tourne Holy Lola, récit initiatique sur les affres de l'adoption à l'étranger.Jacques Gamblin dévoile sa sensibilité de père de famille dans des films aussi divers que Les Irréductibles (2006), Nos retrouvailles (2007) et Le Premier jour du reste de ta vie (2008), une performance qui lui vaut une nomination au César du Meilleur acteur en 2009.
Son charme est également exploité à l'écran par Isabelle Mergault, qui en fait l'amant de Michèle Laroque dans Enfin veuve, tandis que Claude Chabrol aime à le plonger dans l'atmosphère tendue de son polar Bellamy aux côtés de Gérard Depardieu et Clovis Cornillac. Sa ressemblance physique avec Van Gogh lui vaut d'incarner le peintre hollandais dans le moyen métrage biographique Moi, Van Gogh. Il interprète par la suite un sympathisant de Lionel Jospin dans le césarisé Le Nom des gens en 2010 puis un adepte du cerf-volant dans Ni à vendre, ni à louer l'année suivante. En 2012, le comédien change complètement de registre en se glissant dans la peau d'un flic expérimenté et solitaire, à la mine patibulaire, traquant un tueur en série (Lambert Wilson) dans l'inquiétant A l'aveugle de Xavier Palud.
