Acteur dès son plus jeune âge, Josh Hartnett se produit sur les planches de son école, à Minneapolis. Après une formation de comédien à la State University of New York, il s'installe à Los Angeles et apparaît dans des spots publicitaires, puis dans la série télévisée Cracker. Ses débuts sur grand écran, il les vit en 1998 dans le film d'horreur Halloween, 20 ans après. Catalogué au rayon fantastique avec sa participation dans The Faculty (1999) de Robert Rodriguez - ce dernier fera de nouveau appel à lui en 2004 pour l'adaptation du comic book Sin City -, Josh Hartnett change totalement de registre pour interpréter le drame intimiste The Virgin suicides de Sofia Coppola (1999).
C'est en endossant l'uniforme de l'armée américaine dans les grosses productions Pearl Harbor (2001) et La Chute du faucon noir (2002) qu'il accède à la consécration. Devenu acteur de tout premier rang, il aime incarner les jeunes premiers séducteurs dans O (2002), l'adaptation de la pièce de William Shakespeare Othello, la comédie romantique 40 jours et 40 nuits (2003) et Rencontre à Wicker Park (2004), le remake américain du film français L'Appartement. Il va jusqu'à donner la réplique aux plus grands comme Harrison Ford, dont il est le coéquipier dans la comédie policière Hollywood homicide (2003), et le trio formé par Bruce Willis, Morgan Freeman et Ben Kingsley dans le film de gangsters Slevin (2006).
Les plus grands réalisateurs commencent à s'intéresser à lui, ainsi en 2006 il joue aux côtés de sa compagne Scarlett Johansson dans Le Dahlia noir de Brian De Palma puis est dirigé par le réalisateur de Hard Candy dans 30 days of night. Il interprète ensuite un autiste dans Mozart and the Whale puis donne la réplique à Samuel L. Jackson dans Resurrecting the Champ.
