Il naquit à Grand Island, Nebraska, fils de William Brace Fonda et de Herberta Krueger Jaynes. Il a fait ses débuts au théâtre à la fin des années 20, grâce à la mère de Marlon Brando. En 1928, il a intégré la troupe des «University Players» à Broadway. Il n'a rejoint Hollywood qu'en 1935. Henry Fonda a joué ensuite dans près de 90 films et avec les plus grands réalisateurs comme John Ford, Fritz Lang ou Alfred Hitchcock, mais il n'a jamais abandonné le théâtre. Il remporta finalement un Oscar pour sa prestation dans La Maison du lac (On Golden Pond), quelques mois seulement avant sa mort. Il succomba des suites d'un cancer et d'une maladie cardiaque à son domicile de Los Angeles, entouré de sa femme Shirlee et de sa fille Jane, qui joue également dans son dernier film. Son fils Peter est également un acteur. Il est aussi le grand-père de l'actrice Bridget Fonda.
Parmi les films les plus célèbres dans lequel il a joué se distinguent 12 Hommes en Colère - qu'il a également produit -et Il était une fois dans l'Ouest, dans lequel son rôle est à contre-emploi du rôle de l'homme courageux et honnête qu'il a le plus souvent endossé.
