Samuel Le Bihan, après avoir manifesté son intention de devenir peintre, dessinateur ou mécanicien, décide d'être comédien en accompagnant l'un de ses amis au Cours Florent. Après avoir fréquenté cette école parisienne, il se lance dans une expérience de théâtre de rue qui l'emmène sur les routes d'Europe. Puis il décide d'intègrer le Conservatoire et part ensuite s'installer à New York, où il joue le rôle d'une pomme dans une pièce de théâtre expérimentale, et finit par rentrer à la Comédie Française où il reste de 1995 à 1997.Parallèlement, Samuel Le Bihan est repéré par René Féret qui lui offre le rôle principal de La Place d'un autre, une expérience qui lance clairement la carrière du jeune comédien. En 1994, il est à l'affiche de Trois couleurs - Rouge de Krzysztof Kieslowski puis s'illustre dans Une femme française de Régis Wargnier.En 1996, la carrière de Samuel Le Bihan prend un tournant décisif avec son rôle de Norbert dans le Capitaine Conan de Bertrand Tavernier, une performance qui lui vaut d'être nommé aux César dans la catégorie du meilleur espoir masculin. Par la suite, on le voit à l'affiche du Cousin d'Alain Corneau, d'A vendre de Laetitia Masson et de Restons groupés de Jean-Paul Salomé.En 1999, il joue dans Vénus beauté (institut) de Tonie Marshall mais c'est en 2000 que Samuel Le Bihan connaît la consécration. D'abord avec Jet Set de Fabien Onteniente, mais surtout grâce au Pacte des loups de Christophe Gans, un film sur la légende de la bête du Guévaudan dans lequel il incarne le personnage principal, Grégoire de Fronsac. En 2002, Samuel le Bihan est à l'affiche de quatre films : A la folie, pas du tout de Laëtitia Colombani, Une affaire privée de Guillaume Nicloux, 3 zéros, une comédie signée Fabien Onteniente ayant pour cadre le milieu du football, et enfin La Mentale de Manuel Boursinhac, un film policier. Il renoue avec les films d'action avec Fureur, dans lequel il interprète le coach d'un boxeur. Samuel Le Bihan revient en 2004 dans deux films très différents. Il est à l'affiche de , une comédie dans laquelle il a pour partenaire François Berléand et Nadia Farès. En novembre 2004, Samuel Le Bihan participera pour la première fois à un long-métrage étranger : Le Pont du roi Saint-Louis. Il y côtoiera des acteurs prestigieux, Robert De Niro, Harvey Keitel, Gabriel Byrne et Kathy Bates.
Prêtant sa voix au vétéran du circuit Chick Hicks dans le film d'animation Cars (2006) de John Lasseter, il effectue un retour remarqué à l'écran en s'essayant au registre horrifique (Frontière(s), 2007) et en se trémoussant sur des airs de Disco (2008). La même année, il n'hésite pas à prendre 20 kilos pour camper Michel Ardouin, l'un des complices de Mesrine dans L'Instinct de mort, et dans sa suite.
Il débute ensuite l'année 2012 avec un film qui s'inscrit dans le même genre : Une nuit, de Philippe Lefebvre. Il y donne la réplique à Roschdy Zem et à Sara Forestier. La même année, l'acteur porte l'un des principaux rôles du mystérieux Cornouaille de Anne Le Ny, aux côtés de Vanessa Paradis.
