Frère du réalisateur Bruno Podalydès.Denis Podalydès suit des études de lettres avant de s'inscrire au Cours Florent, puis de réussir le Concours du Conservatoire. Il se fait remarquer par sa création d'André le Magnifique en 1996. Jean-Pierre Miquel, son professeur au Conservatoire devenu entre-temps directeur de la Comédie Française, le fait entrer dans cette vénérable maison en 1997. Il reçoit un Molière pour son interprétation du Révizor de Gogol en 1999. En 1989, il fait une première apparition au cinéma dans Xenia. Grâce au film Versailles rive gauche réalisé par Bruno Podalydès en 1991, il prend conscience de son potentiel comique. Il poursuit par la suite sa collaboration avec son frère dans Dieu seul me voit (Versailles-chantiers) en 1997 et Liberté-Oléron en 2001. Entre temps, il multiplie les rôles secondaires dans des comédies. On le retrouve ainsi dans Le Journal du séducteur (1995) de Danièle Dubroux, Rien sur Robert (1999) de Pascal Bonitzer. Cette orientation ne l'empêche pas de se tourner vers des projets un peu plus dramatiques comme Comment je me suis disputé... (ma vie sexuelle) (1996) d'Arnaud Desplechin ou Jeanne et le garcon formidable (1997) de Jacques Martineau et Olivier Ducastel. Il fait même une petite apparition dans Etat des lieux (1994), le premier film de Jean-Francois Richet. Il obtient par la suite des rôles plus importants. Dans La Mort du Chinois (1997) et Les Frères Soeur, il partage la vedette avec José Garcia. En 2000 et 2001, on le retrouve dans des films dramatiques d'une plus grande envergure comme La Chambre des officiers de Francois Dupeyron (2000) et Laissez-passer de Bertrand Tavernier (2001) dans lesquels il ne se départit pas d'une certaine fantaisie. En 2001, il tient le rôle principal de Candidature, le premier moyen métrage d'Emmanuel Bourdieu. En 2002, il est le mari ruiné et suicidaire de Karin Viard dans Embrassez qui vous voudrez, le nouveau film de Michel Blanc, avant d'incarner l'année suivante le reporter Rouletabille dans Le Mystère de la chambre jaune, de son frère Bruno Podalydès.
Denis Podalydès tourne ensuite dans le premier film de Valeria Bruni Tedeschi, Il est plus facile pour un chameau..., avant de partager l'affiche avec Emmanuelle Devos dans Bienvenue en Suisse. En 2005, fort du succès du Mystère de la chambre jaune, il reprend le rôle de Rouletabille dans Le Parfum de la dame en noir toujours sous la direction de son frère. Il s'éloigne ensuite de la comédie le temps de deux films plus graves, Les Ames grises d'Yves Angelo, et Caché de Michael Haneke, pour mieux y revenir ensuite, devant les caméras de Valérie Lemercier dans Palais royal ! ou Marc Fitoussi pour La Vie d'artiste. Après un bref détour par la case "superproduction internationale" avec le Da Vinci Code, Denis Podalydès poursuit cette alternance entre drame et comédie, qui le rend capable de passer du Temps des porte-plumes à Caos Calmo, ou de Coupable à Bancs publics (Versailles rive droite), troisième et dernier épisode de la "trilogie versaillaise" de son frère.
En 2009, au cinéma, il apparaît dans La Journée de la jupe aux côtés d'Isabelle Adjani et dans la comédie Neuilly sa mère ! où il incarne un bourgeois coincé. Deux ans plus tard, il interprète le rôle le plus impliquant de sa carrière, celui de Nicolas Sarkozy, dans La Conquête de Xavier Durringer présenté à Cannes, hors compétition, puis continue dans le film polémique en prêtant ses traits au controversé Pierre-Emmanuel Vaugrenard dans Omar m'a tuer. Il ne s'éloigne pas très longtemps de Cannes et de son festival, puisqu'il y revient en 2012 avec deux films, Vous n'avez encore rien vu d'Alain Resnais et Adieu Berthe ou l'enterrement de mémé, qui marque sa huitième collaboration avec son frère Bruno Podalydès.
