La famille de John Leguizamo émigre aux Etats-Unis alors qu'il n'a que quatre ans, et s'installe dans le Queens, à New York. Diplômé de la New York University en art dramatique, le jeune homme intègre l'Actor's Studio mais ne suivra qu'une journée l'enseignement de Lee Strasberg, qui décède dans la foulée.L'acteur entame sa carrière sur grand écran avec un petit rôle dans Cocaine, et apparaît dans la série Miami Vice. S'il figure au générique d' Outrages, ou encore de 58 minutes pour vivre, c'est cependant en incarnant Johnny dans Hangin' with the Homeboys en 1991 qu'il se révèle, avec un rôle bien plus consistant. Parallèlement, son show Mambo Mouth, dans lequel il croque le portrait de sept latinos, remporte un vif succès et lui permet d'obtenir le Obie Award. Peu après, Brian De Palma l'engage pour L'Impasse, où il compose un étonnant truand face à Al Pacino. La même année, il devient, le temps d'un film, le Luigi de Super Mario Bros. John Leguizamo collabore ensuite à deux reprises avec Baz Luhrmann pour Romeo + Juliet et Moulin Rouge, dans lequel il interprète le peintre Toulouse-Lautrec. Entretemps, il se glisse dans la peau du Clown pour l'adaptation du comic book Spawn, et fait ses débuts à Broadway dans Freak, one man show dont il est l'auteur. Le comédien met également à profit ses capacités vocales en doublant plusieurs personnages de films d'animation (L' Age de glace, Titan A.E.). Après avoir tourné sous la direction de Spike Lee dans Summer of Sam, il partage l'affiche de Dommage collatéral avec le futur Gouvernator Arnold Schwarzenegger, puis campe un malfrat dans Assaut sur le central 13.
