Après cinq années d'études au Conservatoire d'Art Dramatique de Paris sous Antoine Vitez, Jean-Hugues Anglade est révélé par Patrice Chéreau dans L'Homme blessé (1982), où il campe un individu tourmenté par la découverte de sa propre homosexualité. Il s'impose ensuite à l'écran grâce à Luc Besson et Jean-Jacques Beineix qui le dirigent successivement dans Subway et 37°2 le matin, nominé à l'Oscar du Meilleur film étranger.N'hésitant pas à se dévoiler et à donner de sa personne, Jean-Hugues Anglade confirme ses talents de comédien au travers de Maladie d'amour et Nocturne indien avant de retrouver Luc Besson pour les besoins de Nikita. Il se perd un peu en 1994 avec le polar Killing Zoe mais relance aussitôt sa carrière sous l'égide du "maître" de ses débuts, Patrice Chéreau, en interprétant le roi Charles IX dans le drame historique La Reine Margot.En 1996, Jean-Hugues Anglade s'essaie à la réalisation avec Tonka, où il dirige sa compagne Pamela Soo en sprinteuse indienne, mais le film reçoit un accueil glacial. Les échecs successifs du Prof (1999), de Mortel transfert (2001) et de Sueurs (2002) le poussent à tenter sa chance à l'international. Il donne alors la réplique à Connie Nielsen dans le thriller Dark summer (2002) et à Angelina Jolie dans le film policier Taking lives, destins violés (2004) de D.J. Caruso.
En 2007, il est à l’affiche de La face cachée de Bernard Campan et après quelques apparitions à la télé, est de retour au cinéma avec Isabelle Huppert dans Villa Amalia.
En 2009, il enchaîne les projets télé sous la direction de Josée Dayan, qui marque aussi son retour au cinéma avec Persécution où il retrouve le réalisateur Patrice Chéreau.
Peu adepte des comédies, on le voit cependant en 2011 dans Le marquis avec Franck Dubosc et Richard Berry. Il est ensuite à l'affiche du drame Mineurs 27.
Parallèlement à la série Braquo, le comédien se livre à un amour interdit avec Ana Girardot, la fille de son meilleur ami Gérard Lanvin dans Amitiés sincères, puis côtoie Louise Bourgoin dans le drame Je suis un soldat qui évoque le trafic canin.
