Habituée des seconds rôles, Isabelle Nanty apparaît pour la première fois au cinéma en 1983 dans Le Faucon de Paul Boujenah, puis deux ans plus tard dans On a volé Charlie Spencer ! aux côtés de Béatrice Dalle. Toutefois, le grand public ne la découvre réellement qu'en 1990 avec Tatie Danielle, où elle interprête une aide ménagère tyrannique.Tout en multipliant les personnages gouailleurs au grand écran, elle met en scène plusieurs pièces et spectacles au cours des années 90. Son rôle de buraliste hypocondriaque dans Le Fabuleux destin d'Amélie Poulain lui permet d'obtenir une nomination aux César en tant que meilleur second rôle féminin. En 2002, elle incarne Itinéris aux côtés de Christian Clavier et Gérard Depardieu dans Astérix et Obélix : mission Cléopâtre.Forte de son expérience d'actrice et de metteur en scène au théâtre, Isabelle Nanty s'essaie à la réalisation avec Le Bison (et sa voisine Dorine), une comédie dans laquelle deux voisins de palier (elle et Edouard Baer) sont obligés de s'entraider le jour où le mari de l'une part refaire sa vie avec la compagne de l'autre.
L'année suivante, Alain Resnais la dirige dans Pas sur la bouche, comédie dramatique où elle retrouve pour l'occasion Audrey Tautou. Elle enchaîne ensuite quelques films mais qui n'ont pas d'impact sur le public. C'est en 2006 qu'Isabelle Nanty retrouve de son panache en interprétant l'attachée de presse de Jean Rochefort dans Désaccord parfait d'Antoine de Caunes. Habituée aux seconds rôles comiques, elle donne la réplique à Franck Dubosc et Gérard Depardieu, dans le nouveau film de Fabien Onteniente, Disco. Cette même année 2008, Etienne Chatiliez la dirige de nouveau dans une comédie sociale comme il en a le secret, Agathe Cléry.
Au cours des années suivantes, c'est toujours vers la comédie qu'elle se dirige. En témoigne ses personnages d'agent très exigeante de Bénabar dans Incognito (2009) d'Eric Lavaine et de toiletteuse pour chien dans Trésor (id.), le dernier film mis en scène par Claude Berri. L'actrice est également au casting des Tuche (2011) au côté de Jean-Paul Rouve ainsi que du film à sketchs Les Infidèles (2012). Après quoi, Isabelle Nanty renoue avec le succès populaire en retrouvant Pierre-François Martin-Laval qui la dirige dans son adaptation de la BD du même nom Les Profs où elle incarne Gladys, l'enseignante d'anglais très stricte au comportement totalement improbable. Elle retrouve son personnage deux ans plus tard pour sa suite sobrement intitulée Les Profs 2 qui sort en 2015.
L'année suivante, la comédienne est au casting d'une autre suite d'un film très lucratif, Les Tuche 2 - Le rêve américain. Là encore, le succès est au rendez-vous, puisque le long métrage génère plus de 4,6 millions d'entrées, occasionnant donc un troisième opus, Les Tuche 3 : Liberté, Egalité, FraterniTuche.
