Adolescente, Marie Gillain multiplie les cours de danse et de comédie. Passionnée par l'univers du cirque, elle fait partie à 14 ans d'une troupe de théâtre amateur de Liège, et passe bientôt les essais pour le film L' Amant de Jean-Jacques Annaud. Si elle n'est pas retenue, Marie Gillain ne tardera pas à être révélée au cinéma grâce au succès de Mon père ce héros, une comédie de Gérard Lauzier dans lequel elle incarne, à 16 ans, la fille délurée de Gérard Depardieu. Aux suffrages du public s'ajoute en 1995 la reconnaissance critique. Changeant totalement de registre, Marie Gillain est cette année-là l'héroine de L' Appât de Tavernier, qui conte la dérive criminelle de trois adolescents. Ours d'or à Berlin, le film vaut à la comédienne le prix Romy Schneider. Plusieurs fois nommée au César du Meilleur espoir féminin, elle fait par ailleurs des débuts très remarqués sur les planches dans Le journal d'Anne Frank.Au cinéma, Marie Gillain donne la réplique à Isabelle Huppert dans Les Affinités électives de Paolo et Vittorio Taviani, mais c'est avec un autre film d'époque, Le Bossu, qu'elle obtient en 1997 un nouveau succès populaire. Gracieuse et téméraire, elle y manie l'épée aux côtés de Daniel Auteuil. Si elle retrouve Tavernier pour Laissez-passer et tourne bientôt avec Cédric Klapisch, elle est également au générique de plusieurs premiers films, parmi lesquels Laissons Lucie faire (2001) et Tout le plaisir est pour moi (2004).
elle effectue en 2007 son grand retour au cinéma avec pas moins de trois longs métrages : l'adaptation du roman Pars vite et reviens tard de Fred Vargas, le film chorale Fragile(s) et la comédie romantique décalée La Vie n'est pas une comédie romantique.
En 2008, elle donne la réplique à Roschdy Zem et Jean-Paul Rouve en interprétant Mélanie dans La Très très grande entreprise sous la direction de Pierre Jolivet, avant de prêter sa voix à la Tigresse dans le film d'animation Kung Fu Panda pour la version française. S'imposant de plus en plus dans le cinéma français en tant que femme "adulte", on lui propose des rôles plus intenses, plus engagés comme celui de Suzy dans Les Femmes de l'ombre, ou d'Adrienne Chanel dans Coco avant Chanel, avec Audrey Tautou.
Marie Gillain retrouve en 2011 son personnage "vocal" de la Tigresse (dont Angelina Jolie est la voix originale) dans Kung Fu Panda 2, toujours en compagnie de Manu Payet. Elle partage ensuite l'affiche de Toutes nos envies, drame qui nous plonge dans le milieu juridique, avec Vincent Lindon devant la caméra de Philippe Lioret.
