Issu du Conservatoire Stella Adler, Mark Ruffalo débute au Cast Theater et fonde sa propre troupe de théâtre, la Orpheus Theatre Company. Il fait ses premières apparitions au cinéma en 1993 dans Rough trade de Christopher Speidel et There goes my baby de Floyd Mutrux.Coscénariste de The Destiny of Marty Fine avec Michael Hacker en 1996, Mark Ruffalo enchaîne les petits rôles (Casses en tous genres (1998) de John Hamburg ; Studio 54 (id.) de Mark Christopher ; Chevauchée avec le diable (1999) d'Ang Lee), jusqu'en 2000, année de sa consécration. Sa prestation de Terry Prescott dans Tu peux compter sur moi (2001) de Kenneth Lonergan lui vaut alors le prix d'interprétation masculine du Festival de Montréal, le New Generation Award de la Los Angeles Film Critics Association ainsi qu'une citation à l'Independent Spirit Award.Devenant une valeur sûre du cinéma américain, Mark Ruffalo donne la réplique à Robert Redford, dans le film de prison Le Dernier château (2002) de Rod Lurie, et à Nicolas Cage dans Windtalkers (id.) de John Woo. Déclarant forfait pour tourner sous la direction de M. Night Shyamalan dans Signes, il s'illustre avec aisance dans le registre sentimental, jouant les amants de Sarah Polley dans le drame Ma vie sans moi (2003) et de Jennifer Garner dans la comédie 30 ans sinon rien (2004).
En 2007, il joue le rôle d'un inspecteur ambitieux à la recherche du tuer Zodiac, dans le film du même nom. En 2012, Mark Ruffalo est à l'affiche du film "The Avengers" de Joss Whedon, avec Chris Hemsworth, Chris Evans et Scarlett Johansson.Toutefois, cette réussite fulgurante ne l'empêche pas de prendre part à des projets moins commerciaux tel que Margaret, drame plus confidentiel.
Naviguant toujours entre blockbusters et films indépendants, Mark Ruffalo incarne en 2013, l'enquêteur chargé de démasquer le groupe d'illusionnistes et braqueurs de banque dans Insaisissables réalisé par Louis Leterrier (suite prévue pour 2016). L'année qui suit, il joue un producteur de musique déchu, alcoolique, mais convaincu qu'il peut faire d'une jeune femme rencontrée dans un bar (Keira Knightley) une véritable chanteuse, dans New York Melody.
Entre temps, l'acteur participe au tournage de plusieurs drames inédits en France. Ainsi, il s'affiche dans The Normal Heart, évoquant la montée du sida dans les années 80, Thanks for Sharing, l'histoire d'un sex-addict qui tente de se soigner, Red Light Winter, centré sur un triangle amoureux et Spotlight, évoquant la vie d'un prêtre pédophile. Finalement, rappelé par son costume musclé d'Hulk, Mark Ruffalo reprend les chemins de la production Marvel, pour le second numéro des aventures héroïques des Avengers : Avengers : L'ère d'Ultron. Avant la sortie du film en avril 2015, l'acteur livre une performance inoubliable dans Foxcatcher, via le rôle du frère bienveillant du champion de lutte Channing Tatum.
