Né en Virginie, Rob Lowe commence à travailler comme mannequin .A 18 ans, son physique de jeune premier et son charisme poussent le célèbre metteur en scène Francis Ford Coppola à l’engager aux côtés d’une flopée de jeunes talents (Tom Cruise, Matt Dillon, Patrick Swayze, Emilio Estevez, etc.) dans le très lucratif Outsiders (1983). Le comédien au charme ravageur poursuit sur sa lancée avec Class (id.), Hôtel New Hampshire (1984), Oxford Blues (id.), St. Elmo's Fire (1985), Youngblood (1986) et surtout A propos d'hier soir (id., son plus grand succès en tête d’affiche), où il donne la réplique à Demi Moore et James Belushi. Ces nombreux films contribuent à lui forger une réputation d’enfant chéri d’Hollywood.
En 1988, après avoir tenu le rôle d’un gigolo dans le thriller Masquerade (qui n’a pas fait des étincelles au box office), un scandale affecte considérablement sa carrière : la découverte d’une sex tape de ses ébats sexuels avec deux jeunes femmes, dont une mineure… Boudé par le public, la critique et les studios, sa cote de popularité connait alors une chute radicale. En 1990, le réalisateur Curtis Hanson lui offre tout de même de rebondir avec le premier rôle de Bad Influence, où il se risque à interpréter un manipulateur froid et habile, capable de filmer le meurtre qu’il vient de commettre ou les ébats sexuels de sa future victime. Mais, encore offusqué par ses précédentes frasques, le public n’est pas au rendez-vous. Durant les années 1990, Rob Lowe se voit contraint d'enchainer les seconds rôles dans divers téléfilms, comme c’est par exemple le cas dans Wayne's World (1992), Austin Powers (1997) ou Contact (id.).
Si sa carrière cinématographique est au point mort, Rob Lowe se fait progressivement (à l’instar de plusieurs anciennes stars déchues des années 1980) une seconde carrière sur le petit écran dans les années 2000.
Rob Lowe se tourne également vers l’animation, en prêtant sa voix à Simba dans La Garde du Roi Lion (2015-2016), et Moonbeam City (2015). Expérience qu’il renouvelle un an plus tard, avec Monsters Cars (Monsters Trucks).
Ses projets le reconduisent finalement sur le chemin du cinéma avec Super Troopers 2, sequel du premier volet datant de 2001. Rob Lowe renoue même avec son image de jeune séducteur des débuts de sa carrière, en incarnant un gigolo dans How to be a latin lover (2017).
