Ce n'est pas la passion pour l'art dramatique qui a tout d'abord forcé Matthew Lillard à se lancer dans une carrière cinématographique. Le fait de jouer dans les pièces de théâtre de son école lui permettait en effet d'oublier ses réguliers problèmes scolaires. Il obtient néanmoins ses diplômes, et débute dans un petit rôle sur le film d'horreur Ghoulies 3 : Ghoulies Go to College.Démontrant de réels talents d'acteur, Matthew Lillard passe avec succès les castings des thrillers Serial Mother de John Waters et Hackers en 1995. L'acteur acquiert une véritable notoriété un an plus tard, en prêtant ses traits au personnage du déjanté Stuart Macher dans le film d'épouvante Scream.Matthew Lillard surfe sur la vague du succès remporté par le film de Wes Craven, l'acteur privilégiant dans ses choix de carrière des films d'épouvante (Cursus fatal en 1998, 13 fantômes en 2001) ou des films destinés aux adolescents (Elle est trop bien et Wing Commander en 1999). Matthew Lillard retrouve en 2002 son ami Freddie Prinze Jr. pour la quatrième fois dans le film Scooby-Doo et Scooby-Doo 2 : les monstres se déchaînent.
